液体活检DNA甲基化标志物在肿瘤诊治中的实践与挑战
为了提高临床液体活检测试的成功几率，在生物标志物发现阶段就应选择合适的样本类型。迄今为止，组织样本最常用于生物标志物发现，并已产生高精度肿瘤生物标志物，随后在液体活检中检测到。将液体活检样本直接纳入发现阶段可能具有独特优势，允许识别在体液中固有可检测的生物标志物， 有望减少从发现到临床应用的步骤。越来越多基于甲基化的高通量方法直接使用cfDNA作为起始肿瘤源性物质，并表明通过这种方法识别的生物标志物具有稳健性能。作为概念验证，Hlady等人证明直接从cfDNA中识别出的候选生物标志物，其表现优于主要从组织样本中识别的标志物。诸如循环游离基因组图谱（the Circulating Cell-free Genome Atlas, CCGA）研究等努力也成功促成了用于检测和预测多种肿瘤类型及其组织来源的生物标志物组合的发现，且具有高特异性。
生物标志物测试的性能和可靠性最终取决于分析所用DNA的数量和质量，无论是在发现阶段还是后续的靶向分析中。因此，优化分析前步骤至关重要，特别是对于液体活检肿瘤源性物质，其目标DNA通常含量低、易降解且被其他细胞和DNA片段的复杂背景所包围。事实上，cfDNA降解和正常白细胞DNA污染是可能损害血液检测分析性能的主要分析前变量。采血管类型、处理时间、储存温度、离心方案和DNA纯化方法等因素均显著影响下游分析可用cfDNA的质量和数量。对于尿液样本，处理时间和储存温度尤为重要。虽然沉淀方案传统上是尿液处理的金标准，但已开发出替代解决方案（如稳定缓冲液和尿液过滤系统）以简化样本在运输和储存过程中的处理和保存。对于胆汁，苯酚-氯仿萃取法已被证明比其他分离试剂盒能获得更高水平的可扩增DNA。多个研究机构，包括CANCER-ID项目、欧洲液体活检协会（ELBS）和BLOODPAC，正在持续努力标准化分析前变量，为改善液体活检生物标志物的临床转化做出重要贡献。
为了在下游分析中检测DNA甲基化，通常需要进行DNA预处理步骤。亚硫酸氢盐转化被认为是这方面的金标准，有多种商业试剂盒可用，它们在DNA回收率和转化效率上存在差异。研究也报道了将不同亚硫酸氢盐转化试剂盒和cfDNA分离试剂盒组合用于血浆DNA甲基化分析时，DNA产量和回收率存在变异性。尽管作为金标准，亚硫酸氢盐转化处理剧烈，会导致显著的DNA降解，这对于本就DNA有限的液体活检肿瘤源性物质尤其具有挑战性。近年来，使用TET2和APOBEC酶的酶学转化（EM-seq）作为一种更温和、有前景的替代方案被提出。与亚硫酸氢盐转化相比，该方法能产生更长的DNA片段，但平均cfDNA回收率较低（38% vs. 68%）。因此，对于液体活检中基于PCR的DNA甲基化生物标志物分析，亚硫酸氢盐转化似乎仍是首选方法，而酶学转化可能更适合需要更长DNA片段的测序方法。
新候选生物标志物的发现受益于高通量技术的进步和简化的生物信息学流程。基于微阵列的分析和全基因组甲基化测序被广泛用于此目的。DNA甲基化阵列价格合理，且生物信息学流程成熟。大量研究通过阵列在不同恶性肿瘤中识别出肿瘤与对照之间差异甲基化的CpG位点，这些位点可能构成有前景的肿瘤检测候选标志物。特别是商业化的用于膀胱癌检测的EarlyTect BCD测试即源于基于阵列的生物标志物发现。虽然微阵列覆盖一组选定的CpG位点，但甲基化组测序提供更广的基因组覆盖范围，这有助于设计和开发更精确、可能更准确的生物标志物检测方法用于后续靶向验证。更广的覆盖范围还允许在先前未探索的区域识别具有相关甲基化模式的序列，无论其基因组位置或潜在功能如何。识别新DNA甲基化生物标志物的常用策略集中于功能相关位置，如转录起始位点附近的CpG岛，这些位置的DNA甲基化状态可能影响基因表达。然而，最近研究表明，高性能的DNA甲基化生物标志物并不局限于具有已知生物学功能的基因组区域。这表明，将搜索范围扩展到传统探索区域之外，可以揭示新的高性能生物标志物，这些可能被传统策略所忽略。
一些有前景的发现研究已使用WGBS分析血浆cfDNA。在这些计划中，Grail's Galleri测试已成为一种商业可用的工具，用于多种肿瘤的早期检测。这种基于血液的测试使用下一代测序（NGS）数据结合机器学习分类器来识别cfDNA中的DNA甲基化模式，可能在有症状前检测超过50种肿瘤类型。同时，基于富集的技术已被证明是成本效益高的全基因组甲基化分析方法。例如，MeDIP结合片段测序已成功用于检测多种肿瘤的cfDNA甲基化。与WGBS相比，RRBS降低了所需测序量，同时仍能捕获大多数受DNA甲基化影响的基因组区域。人们对第三代测序技术（如纳米孔测序）也寄予厚望，它无需亚硫酸氢盐转化即可实现先进的实时DNA甲基化检测。预计该技术将克服与液体活检中cfDNA分析相关的若干挑战，包括DNA片段中断、GC偏好性以及亚硫酸氢盐处理引起的降解问题。作为原理验证，Lau及其同事成功使用纳米孔测序监测了肿瘤患者治疗期间纵向cfDNA甲基化动态。