液体活检DNA甲基化标志物在肿瘤诊治中的实践与挑战
国际肿瘤研究机构（The International Agency for Research on Cancer, IARC）近期预测，全球肿瘤发病率将显著上升，预计到2050年新发肿瘤病例将超过3500万。这一预期增长对医疗卫生系统提出了更高要求，也凸显了加强肿瘤管理策略的迫切性。为应对这一挑战，液体活检作为一种微创手段，为检测多种肿瘤生物标志物提供了可能，这些标志物可用于筛查、诊断、预后评估、微小残留病变检测、复发早期识别及治疗反应预测等多个方面。肿瘤以循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）和外泌体等形式，释放肿瘤源性物质到血液、尿液、唾液、胆汁和精液等多种体液中。与组织活检相比，液体活检在生物标志物发现方面展现出多重优势：组织活检仅能提供肿瘤局部信息，而液体活检则能反映患者的整体肿瘤负荷和肿瘤的分子异质性。此外，液体活检通常创伤更小，并支持重复取样，可用于监测治疗反应和疾病进展。
DNA甲基化是指在胞嘧啶的5'位点添加一个甲基，通常发生在CpG二核苷酸上，形成5-甲基胞嘧啶。这种表观遗传修饰在不改变DNA序列的前提下，调控基因表达和染色质结构，对基因组印记、X染色体失活、转座子沉默以及细胞发育与分化等过程至关重要。在肿瘤中，DNA甲基化模式常发生改变，典型表现为全基因组低甲基化与CpG富集基因启动子区域的高甲基化并存。关键抑癌基因启动子的高甲基化通常导致基因沉默，而全局低甲基化则可能诱发染色体不稳定性，这些变化共同扰乱了正常生长通路，驱动恶性转化。
DNA甲基化改变常在肿瘤发生早期出现，并在肿瘤演进过程中保持稳定，这使得肿瘤特异的DNA甲基化模式成为极具潜力的生物标志物。DNA双螺旋结构因其互补碱基配对和螺旋构象而具有固有稳定性，相比单链核酸生物标志物能提供额外保护。然而，循环游离DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）在血液中清除迅速，半衰期估计从几分钟到几小时不等，这对基于血液的生物标志物分析构成了挑战。在此背景下，DNA甲基化生物标志物展现出优势，因为甲基化状态似乎会影响cfDNA的片段化模式。核小体相互作用有助于保护甲基化DNA免受核酸酶降解，导致甲基化DNA片段在cfDNA池中相对富集。总体而言，这些特性使得基于DNA甲基化的生物标志物潜力巨大，尤其是在样本采集、储存和处理过程中，相较于RNA等更不稳定的分子，它们表现出更强的抗降解能力。
分析DNA甲基化的方法多种多样。全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）通过亚硫酸氢盐化学转化广泛用于生物标志物发现，提供广阔的甲基化组覆盖范围。酶学甲基化测序（EM-seq）以及新兴的第三代测序技术（如纳米孔测序和单分子实时测序）则无需化学转化即可实现全面的甲基化分析，从而更好地保持DNA完整性，这对于DNA量通常有限的液体活检分析尤其具有前景。微阵列和基于富集的技术（如甲基化DNA免疫共沉淀测序，MeDIP-seq）通过在检测广度与成本、通量之间取得平衡，同时支持生物标志物的发现和临床验证，但这些方法提供的甲基化信息细节不如全基因组测序方法。靶向方法，如定量实时PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR），能进行高度灵敏的位点特异性分析，使其特别适用于临床验证。
尽管潜力巨大，基于DNA甲基化的肿瘤生物标志物在常规临床中的应用仍然有限。在PubMed数据库中，同时使用“生物标志物”、“DNA甲基化”和“肿瘤”这三个MeSH术语进行检索，自1996年以来共有6191篇相关论文。然而，如此大量的研究并未转化为临床应用的DNA甲基化生物标志物的数量，这凸显了开发稳健、高性能的DNA甲基化生物标志物所面临的挑战。影响DNA甲基化生物标志物成功临床实施的因素众多。液体活检中肿瘤源性物质含量低，需要先进技术进行标志物发现和验证，包括优化的发现流程和标准化的靶向分析。此外，液体活检来源的选择、发现和验证阶段合适对照组的选择、充分的独立验证以及大规模临床研究以证明临床效用，都是影响临床转化成功几率的重要因素。以下将主要围绕诊断性DNA甲基化生物标志物展开讨论。
液体活检来源
血液是液体活检分析最常用的来源之一。循环系统几乎遍布全身所有组织，使得血液能够汇集来自不同解剖位置肿瘤脱落的肿瘤特异性物质。随着肿瘤的生长和演进，ctDNA、CTCs和细胞外囊泡均可释放入血液。血液通过微创操作易于获取，从患者角度而言更具吸引力。然而，检测循环肿瘤生物标志物具有挑战性，因为肿瘤来源的信号在成人平均4-5升的总血容量中被高度稀释，通常浓度极低，难以检测。同时，ctDNA极不稳定，降解迅速。此外，血液中含有多种其他成分，包括白细胞和来自各健康组织的cfDNA片段，这种复杂的背景不仅稀释了肿瘤来源的信号，还可能导致假阳性，从而降低靶向分析的特异性。